Докторские байки

Шмерососы для молекулярных биологов Москвы Московские власти решили усилить борьбу со шмерами на агарозных гелях и разработали "шмерососы". Маленькие помощники помогут московским ученым получать чистые гели и получать результаты достойные журналов из белого списка ВАКа.

Будь со мной нежен vs да ладно, что ты Обычно при очистке белков ученые вынуждены быть особенно внимательными к условиям очистки для того, чтобы избежать денатурации белков. Очистку проводят при охлаждении, подбирают pH и добавляют стабилизирующие растворы. Но мир белков потрясающе разнообразен - и некоторые белки спокойно выдерживают жесткие условия, которые для большинства их полипептидных собратьев смертельны. Так и в случае адгезивных белков из моллюсков - в статье ученые используют для экстракции разбавленную хлорную кислоту, а для осаждения подкисленный ацетон. И ничего, белок живее всех живых! Этот класс полифенольных белков (mussel adhesive proteins, MAPs) интересный пример природного клея - с помощью них мидии и прочие моллюски способны приклеиваться наже на мокрых поверхностях в море. А все дело в модификациях аминокислот, они богаты катехольными (полифенольными) группами, в первую очередь за счёт аминокислоты DOPA (3,4‑дигидроксифенилаланин). Эти модификации работают на трех уровнях: начальные нековалентные взаимодействия (адгезия), затем окисление до хинона и образование ковалентной сетки, и одновременно формирование металл‑катехольных координационных связей. Теперь вы знаете, как в условиях пост-апокалипсиса получить клей для влажных поверхностей! Вам понадобятся мидии, хлорая кислота, ацетон и солянка. Энжойте!

Как синтезировать аффинный сорбент. Эпокси активация матрицы Продолжение постов про получение аффинных сорбентов (начало - тут). Эпокси активация сефарозы - это классический способ активации , при котором на поверхности матрицы формируются эпоксигруппы, способные к ковалентному связыванию лигандов. Я активировал эпихлогидрином, простым и доступным эпокси-реагентом. Еще круче - активировать бис-оксиранами (1,4 -бутандиол диглицидиловый эфир), но он дороже. Руслан @Biophyschem рассказывал, что успешно использовал для активации технический 1,4 -бутандиол диглицидиловый эфир купленный на озоне - она используется как разбавитель эпоксидной смолы. После активации на сефарозе появляются эпоксигруппы, которые могут реагировать с аминными, тиольными и гидроксильными группами лигандов, что делает метод универсальным по сравнению с CNBr. Если вы беспокоитесь о токсичности BrCN - эпоксиактивация отличная альтернатива. Преимущества этого метода: 1. Менее токсичные реагенты, по сравнению с BrCN 2. Можно связывать не только по аминогруппам, но и по тиолам и даже гидроксилам (всего-то нужно поменять pH конъюгации) 3. По сравнению с BrCN активацией связь гораздо прочнее, практически отсутствует утечка лиганда. Проще повторно использовать. 4. Связь образуется через гидрофильный спейсер, в случае эпихлоргидрина это три атома углерода, если брать диглицидиловые эфиры -от 6 до 12! 5. Активированный сорбент можно хранить и использовать позднее. 6. Не остается заряженных групп. Недостатки тоже есть: 1. Реакция иммобилизации происходит в щелочных условиях, не всем белкам может подойти 2. Активация проходит дольше 3. По моему опыту - как будто бы емкость получается ниже, чем в случае BrCN 4. Эпокси реагент помимо активациии сорбента может и участвует в кросс-сшивке, с уменьшением пористости микросфер. Для проведения эпоксиактивации я использовал метод, описанный в статье Matsumoto (1979). В замечательной книге Hermanson на стр. 691 также есть протокол (но без DMSO и более долгий). Если кратко - сефарозу ресуспендируют в смеси 0,4M NaOH и DMSO, добавляют эпихлоргидрин и оставляют активироваться на 2 ч при температуре 40С. Потом остается только отмыть, добавить белок в щелочном буфере и проинкубировать. После конъюгации сорбент нужно отмыть и заблокировать оставшиеся эпокси группы и снова отмыть. Неиспользованный активированный сорбент можно хранить в воде с консервантами в холодильнике. Энжойте и получайте аффинный сорбент просто!

Самый первый гель Слюнявчик с гелем - чтобы не облиться буфером!

Не храните долго раствор SDS! Додецильсульфат натрия, или SDS, широко применяется в молекулярной биологии, особенно в электрофорезе в денатурирующих условиях (SDS‑PAGE). Молекула SDS - это производное алифатического спирта (додеканола), в котором гидроксильная группа заменена на сульфатную через эфирную связь. Со временем эта эфирная связь может разрываться. В результате образуются спирт додеканол, который плохо растворим в воде, и серная кислота или сульфат‑ион (в зависимости от pH). Раствор при этом закисляется, может выпасть осадок. В целом SDS при нейтральном pH довольно стабилен, но в кислых или основных условиях и при нагреве распад ускоряется. С сухим порошком, кстати, гидролиз также может происходить - из‑за гигроскопичности сульфатной группы. Эта реакция является автокаталитической: при гидролизе выделяются ионы водорода, которые ускоряют дальнейший гидролиз. Отсюда важные выводы: 1. При сомнениях в свежести проверяйте pH - свежеприготовленный 1% раствор SDS имеет pH ~6.5. Если раствор хранился несколько лет, pH может упасть до 3.5-2.5. 2. Сухой порошок храните герметично закрытым, желательно запарафильмить. Очень старый SDS, с советских времен, перед использованием лучше проверить. Энжойте и следите за своим SDS!

С международным днем химика! "Нельзя смотреть на лабораторию, все равно какую, учебную ли, производственную ли или экспериментальную, как на какое-то временное местопребывание. Всякая лаборатория — пусть даже химик находится в ней временно — должна быть близкой, родной" Из "Техники лабораторных работ" Воскресенского, второе издание, 1937 год. В более поздних изданиях эта нежность была потеряна, сплошной канцеляризм.

Когда лень гонять реальный блот Ну что все так ополчились на Термо. Фотошопные картинки не обязательно свидетельствуют, что антитела не работают. Может термовцем было просто лень блот гонять? Как у Даниила Хармса: “…Выходит маленькая девочка. М а л е н ь к а я д е в о ч к а: - Папа просил передать вам всем, что театр закрывается. Нас всех тошнит”

Не выбрасывайте пенку из бульона! В кулинарной книге Л.И. Словцовой “Здоровый стол” (1930) настостельно рекомендуется не уподобляться французам и не выбрасывать пену из супа. Ведь пища - не удовольствие, а удовлетворение насщных потребностей тела. Каждый грамм белка ценен!

Гордость и предубеждение и белок мочи В 2010 году ученые открыли белок в моче мышей, который притягивает самок к запаху конкретного самца. И назвали этот феромон Darcin - в честь мистера Дарси, героя романа Джейн Остин «Гордость и предубеждение», от которого теряет голову героиня. Интересно, что этот белок не просто привлекает - он напрямую влияет на выбор партнера.

Главное - как акценты расставить! Стоит много денег? Да! Дорого ли? Конечно нет!

Как синтезировать аффинный сорбент. Активация матрицы Для ковалентной иммобилизации белков матрицу необходимо предварительно активировать. Методов активации очень много, подробнее можете почитать в рекомендованных книгах (+ Остреман). Ниже приведены основные принципы и практические моменты для метода активации бромцианом, без избыточной детализации условий реакции. Материал предназначен только для специалистов и носит ознакомительный характер. Буду рад, если в комментариях поделитесь своими лайфхаками и советами про активацию сорбентов. Активация бромцианом CNBr активация сефарозы является классическим быстрым методом, разработанным в 1960х годах сотрудниками компании Pharmacia. В щелочной среде бромциан реагирует с -OH группами агарозы и образует реакционноспособные промежуточные структуры, преимущественно эфиры цианатов и производные имидакарбоната. Эти группы легко взаимодействуют с аминогруппами белков, в результате чего формируется ковалентная связь. Метод отличается высокой скоростью и удобством, однако имеет ряд ограничений: используется токсичный реагент, активированные группы нестабильны и должны использоваться сразу после получения, формируемая связь может вносить дополнительный положительный заряд, а сама реакция не является строго сайт специфичной, что иногда влияет на активность белка. Изомочевинная связь нестабильно при низких pH и со временем колонка начинает подтекать (после эпокси-активации связь гораздо стабильнее). Важно! Соблюдайте технику безопасности! Все операции с бромцианом проводят строго в вытяжном шкафу, так как реагент токсичен и летуч. Растворы после реакции также остаются токсичными. Для их нейтрализации и обработки посуды используют щелочной раствор с добавлением сернокислого железа, например 0.5 M Na2CO3 с добавлением примерно 50 мМ FeSO4, выдерживая около 15 минут. На практике сефарозу ресуспендируют в холодном буфере с высоким pH. Буфер следует выбирать без аминогрупп. Перемешивание предпочтительно проводить с использованием верхнеприводной мешалки, так как мешальник магнитной мешалки может механически разрушать гранулы матрицы. Для активации требуется pH порядка 9-10 и охлаждение. В ряде работ рекомендуют контролировать pH с помощью pH метра и корректировать его щелочью, однако более удобным является использование концентрированного карбонатного буфера. Например, в работе March (1974) предложено проводить реакцию в 2 M растворе карбоната натрия, который обеспечивает достаточно высокий pH и буферную емкость без необходимости постоянного контроля. В таких условиях к сефарозе добавляют реагент для активации и проводят активацию в течение 1-2 минут. После этого матрицу быстро переносят на фильтр Шотта и последовательно промывают холодным щелочным буфером, водой и буфером, предназначенным для последующей коньюгации. Сефарозу слегка подсушивают на фильтре, затем переносят в подходящую пробирку, добавляют белок в буфере и проводят иммобилизацию при перемешивании при +4 C в течение нескольких часов, часто оставляя на ночь. После завершения реакции сорбент тщательно отмывают и оценивают эффективность иммобилизации.Далее блокируют оставшиеся активные центры и все, можно работать! Важные моменты 1. Стандартные лопатки мешалок часто слишком велики для небольших объемов, поэтому удобно изготовить компактный вариант,например из пластикового шпателя Дригальского. 2. Охлаждать можно, добавляя лед в реакционную смесь (при больших объемах). 3. Дин (1988) указывает, что Трис использовать можно, так как аминогруппа экранирована. 4. Бромциан лучше вводить в виде раствора в ацетонитриле, что повышает воспроизводимость и удобство работы; такой раствор можно хранить при температуре около -70 C. Для оценки эффективности иммобилизации можно использовать качественное окрашивание кумасси, а также количественные подходы, например измерение оптической плотности суспензии в глицерине. Часто применяют оценку по содержанию несвязавшегося белка в супернатанте и промывках, однако этот метод не всегда дает точную картину. 5. Блокировать можно глицином, этаноламином, гидроксиламином.

Как синтезировать аффинный сорбент. Матрица Матрица – то, к чему будет пришиваться белок. Спектр твердых фаз для иммобилизации довольно широкий. Это могут быть не только хроматографические сорбенты, но и фильтровальная бумага, стеклянные шарики, силикагель, лунки полистирольных планшетов и т.д. Но для очистки белков самый удобный вариант - модификация хроматографического сорбента. На мой взгляд, самый универсальный вариант - это сефароза (агароза). Это полисахаридная матрица, достаточно жесткая, химически устойчивая, с хорошими потоковыми характеристиками. А самое главное - в сефарозе много гидроксильных групп, которые несложно модифицировать. Для активации подходит как обычная сефароза, так и кросс-сшитая (CL, cross-linked). Существуют предактивированные матрицы, но, на мой взгляд, это избыточно - все достаточно просто сделать в лаборатории. Другой вариант - целлюлозные матрицы. Их также удобно модифицировать по гидроксильным группам, но физико-химические свойства уступают сефарозе. Пористость целлюлозных матриц значительно ниже, они хуже выдерживают давление и работают медленнее. Биологическая устойчивость также ниже. Однако они дешевле и доступнее, поэтому могут использоваться для разовых решений. Рассматривать их как основу имеет смысл только при отсутствии сефарозы. Полиакриламидные матрицы по механической стабильности и устойчивости к микробной деградации превосходят сефарозу. Их важное преимущество - отсутствие проблемы взаимодействия с сахар-связывающими белками (например, лектинами). Однако самостоятельно модифицировать полиакриламидную матрицу существенно сложнее. Амидные группы плохо поддаются активации, а методы их модификации часто требуют жестких условий, которые могут частично разрушать матрицу, а также использования реагентов, которые сложнее достать. Поэтому в производстве активные группы обычно вводят еще на стадии синтеза матрицы. В обычной лаборатории работать с такими матрицами менее удобно. При этом существуют готовые решения, например Profinity Epoxide Resin от Bio-Rad, позволяющие реализовать преимущества полиакриламидной основы. Итак, если суммировать: при необходимости получения аффинного сорбента оптимальным выбором в большинстве случаев является сефароза. Наиболее распространенные варианты - Sepharose 4B и Sepharose 6B, а также их кросс-сшитые версии - Sepharose 4B CL и Sepharose 6B CL (CL, cross-linked). Sepharose 4B более пористая (предел исключения около 20 МДа), но менее прочная. Sepharose 6B менее пористая (предел исключения около 4 МДа), но механически более устойчива. Для крупных объектов, таких как IgM, вирусы, предпочтительнее использовать 4B. Для белков среднего размера чаще выбирают 6B. В кросс-сшитых вариантах часть гидроксильных групп задействована в формировании сшивок, поэтому теоретическая емкость может быть немного. Однако на практике это редко является критичным, в то время как механическая прочность и жесткость существенно возрастают. Поэтому для работы при повышенных потоках или в хроматографических системах предпочтительнее использовать CL-версии. Еще более устойчивым вариантом являются Fast Flow версии сефарозы - они обладают повышенной жесткостью и лучше подходят для работы при высоких скоростях потока. Теперь вы знаете как выбирать матрицу. В следующем посте расскажу про методы активации.

Она все-таки крутится! Удивительно, но центрифуги с ручным приводом все еще производятся и продаются! На фото - ручная центрифуга фирмы Hettich (студенты в комплект не входят).

Как получить аффинный сорбент Аффинная хроматография - это эффективный метод очистки белков, основанный на специфическом сродстве белка и закрепленного на носителе (матрице) лиганда. Часть аффинных сорбентов доступна коммерчески, но довольно часто нужный сорбент невозможно купить, и его приходится синтезировать самостоятельно. Существует много интересных подходов разной степени сложности. Не все из них легко реализовать в обычной лаборатории. В серии постов расскажу общий подход к иммобилизации белков на сорбенте в условиях стандартной молбио/биохимической лабы. Самый простой способ получить аффинный сорбент - использовать коммерческие предактивированные матрицы. Они удобны в работе, безопасны и часто дают более высокую емкость по сравнению с самодельными вариантами. Обычно активная группа соединена с матрицей через спейсер, что снижает стерические ограничения при связывании таргетного белка. Сама процедура иммобилизации максимально простая: как правило, достаточно добавить белок в подходящем буфере и подождать. Но, конечно, такой подход заметно дороже самодельных решений. Если вам ближе путь самурая, вот несколько книг, которые я рекомендую тем, кто хочет разобраться в синтезе аффинных сорбентов: 1. Greg T. Hermanson. Bioconjugate Techniques. Безусловный номер один. Подробнее про нее тут. 2. David M. Jameson, Shan S. Wong. Chemistry of Protein and Nucleic Acid Cross-Linking and Conjugation (2012). Больше внимания уделено химии процессов, хорошая книга. 3. Дин П. Аффинная хроматография. Методы (1988). Перевод на русский, хрошая книга с разбором классических методов активации и даже описанием получения самих сорбентов.