Докторские байки

Мертвые тушки для школы или уроки биологии, которые мы потеряли В книге Сергея Андрониковича Павловича "Самодельные пособия по ботанике и зоологии" 1954 г. приводятся простые рецепты изготовления демонстрационных материалов для уроков биологии. Язык пособия простой и доходчивый, протоколы - без этих ваших чрезмерных предосторожностей и обхода углов. Если для студня на кухне вываривают голову свиньи или теленка, то необходимо потом для школы взять челюсть с зубами. При случае для школы можно изготовить тушки животных. Нередко можно найти мертвого, совсем свежего крота. Взрежьте кожу на брюшной стороне. Внутри этого разреза ухватите ноги одну за другой за колено, подтяните кверху, сгибая в колене, перестригите ножницами ноги внизу голени. То же сделайте с передними конечностями. Кости и ступни с пальцами останутся при шкурке. Выворачивая шкурку чулком, снимите ее с головы крота. Перестригите голову поперек, чтобы челюсти остались при шкуре. Случается найти и мертвую летучую мышь. Это очень ценная находка. Засохшую мышь монтируют в рамочке (стенки ящичка) между двумя стеклами. Круто же! Не противная мертвая тушка, а ценная находка для юного биолога! Энжойте! P.S. Про еще одну книгу автора я уже писал - про то, как сделать колбу для перегонки из лампочки.

IMAC - как сделать все не так! После замечательной статьи великого Пората 1975 года (J. Porath) метод металлохеллатной хроматографии (IMAC - immobilized metal affinity chromatography) начал активно использоваться для аффинной очистки белков. Сейчас в подавляющем большинстве приложений метод используется для очистки рекомбинантных белков с гис-тэгом. Но исходно-то его активно использовали для природных белков! Метод удобный, быстрый, относительно недорогой, дает приличную степень очистки. Но есть способы запороть эксперимент по очистки или понизить эффективность. 1. Использовать слишком большой объем сорбента Это очень распространенная ошибка, я и сам в аспирантуре наступал на эти грабли. Большой объем сорбента увеличивает время контакта белка с иммобилизованными ионами металла и площадь неспецифического связывания. Часто это приводит к снижению чистоты, разбавлению целевого белка при элюции и перерасходу сорбента. Поэтому разумно вначале прикинуть содержание целевого белка и брать сорбент, так, чтобы нагрузка была ~ 75% динамической емкости. Часто это наблюдается при очистке на готовых картриджах для IMAC - там-то объем сорбента уменьшить нельзя. Поэтому если белка мало, иногда проще почистить в gravity-flow колонке, вручную. Лайфхак при очистке на картридже малого количества белка - элюировать в обратном направлении. Тогда белок не прогоняется через весь объем колонки и не разбавляется, а выходит в более концентрированном виде. Для элюции можно колонку перевернуть или, если на вашем хроматографе Bio-Rad NGC есть колоночный клапан просто выбрать в программе Reverse. 2. Повторно проводить IMAC Повторная IMAC редко существенно повышает чистоту, если примеси связались в первый раз, свяжутся и во второй. При повторном прогоне возрастает риск агрегации, потери выхода и загрязнения белка выщелоченным металлом. Лучше использовать ортогональную стадию очистки (SEC, IEX и др.). 3. Наносить образец в слишком кислом буфере При низком pH происходит протонирование имидазольных групп гистидинов, которые теряют способность координировать металл. В результате His-tag связывается слабо или не связывается вовсе. Для большинства IMAC оптимален pH 7,0-8,0. 4. Наносить образец с соединениями, которые хелатируют ионы металла EDTA, EGTA, цитрат и другие хелаторы конкурируют за ионы Ni²⁺, Co²⁺, Cu²⁺ и могут частично или полностью удалить металл из сорбента. Это снижает емкость колонки и ухудшает связывание белка. Если есть хелаторы, например в культуральной жидкости можно просто разбавить или испол зовать для захвата ионообменку. Или использовать IMAC сорбенты с прочно связанным ионом металла, с пятидентантными хелаторами. Но их емкость обычно в 4-5 раз меньше. 5. Добавлять слишком много восстановителей в буфер DTT относится к наиболее проблемным восстановителям для IMAC и может вызывать потерю никеля. β-меркаптоэтанол значительно безопаснее. Перед работой нужно хорошенько промыть сорбент водой, чтобы убрать свободные ионы металла. 6. Не учитывать мешающие очистке компоненты Есть много неочевидных примесей, которые влияют на связывание - некоторые аминокислоты, ионы аммония, органические кислоты. Обычно мешающие примеси приводятся в инструкции к сорбенту. 7. Чистить сорбент после хроматографии NaOH не снимая ион металла В щелочной среде металл может образовывать нерастворимые гидроксиды (например, Ni(OH)₂), которые осаждаются внутри матрицы и ухудшают работу сорбента. Перед обработкой NaOH колонку обычно разряжают (стрипят) и удаляют ионы металла. А вообще щелочь - подарок небес для хроматографиста! Нужно только убедиться, что матрица держит щелочь. 8. Не чистить сорбент или чистить редко. На колонке накапливаются прочно связанные белки, липиды, нуклеиновые кислоты и продукты деградации. Это приводит к снижению емкости, росту противодавления, ухудшению воспроизводимости и увеличению неспецифического связывания. Энжойте и чистите белки эффективно! А как избежать ошибок при форезе описал тут.

Термос в эпоху постапокалипсиса Если в пустоши понадобится перенести образцы или реагенты, а термоса нет - помогут наставления предков. На фото устройство термоса из подручных материалов из кулинарной книге Л.И. Словцовой “Здоровый стол” (1930). Энжойте! Теперь вы готовы к термостатированию в условиях ограничений!

Varigrad - девятикамерный градиент-формер эпохи титанов Во многих методах хроматографической очистки белки элюируют с колонки, изменяя содержание элюирующего компонента в буфере. При ионообменной хроматографии самый простой способ элюции - промыть колонку раствором с высокой концентрацией соли (ударом). Но тогда с колонки сойдут практически все связанные белки одновременно. Можно проводить элюцию порциями, постепенно повышая концентрацию соли. Это уже позволяет получать более чистый препарат (ступенчатая элюция). Однако самый тонкий вариант - градиентная элюция, при которой концентрация соли повышается непрерывно. По сути, это разновидность ступенчатой элюции с очень маленькими шагами. Для создания градиента концентрации соли в современных хроматографических системах смешивают буферы с низким и высоким содержанием соли, подавая их с разной скоростью и смешивая в миксере. А если под рукой нет автоматической хроматографической системы, можно использовать градиент-формер и перистальтический насос. Чаще всего градиент-формер представляет собой два цилиндра, соединенных между собой и с отводом на колонку. Один цилиндр называется смесительной камерой. В нем исходно находится буфер с низкой концентрацией соли и установлена мешалка. Когда насос отбирает жидкость из смесительной камеры и подает ее на колонку, уровень жидкости снижается, и туда начинает поступать буфер из второго цилиндра с высокой концентрацией соли. Растворы постоянно перемешиваются, а смесь непрерывно подается на колонку. Так формируется плавный градиент концентрации соли, который позволяет разделять белки с близким зарядом. Примеры таких градиентных устройств можно найти здесь и здесь. Двухкамерный градиент-формер позволяет получать линейные, вогнутые и выпуклые градиенты. Однако с его помощью нельзя реализовать более сложные профили - S-образные, зеркальные или составные. В 1960-х годах, в эпоху титанов, Петерсон и Собер - создатели ионообменных целлюлоз DEAE-cellulose и CM-cellulose - предложили невероятный вариант градиент-формера с девятью камерами - Varigrad! Varigrad - это многокамерный градиент-формер для хроматографии, созданный для получения градиентов элюента практически произвольной формы, а не только простых линейных или экспоненциальных профилей. Главная идея состояла в том, что вместо двух сосудов использовалась серия одинаковых камер, соединенных между собой. Все камеры находились в гидростатическом равновесии, и по мере отбора жидкости из первой камеры это равновесие постоянно восстанавливалось за счет перетекания раствора между соседними камерами. При этом каждая камера непрерывно перемешивалась собственной мешалкой. Varigrad позволял не просто изменять концентрацию соли от 0 до 100 %, а распределять элюирующую силу именно там, где она необходима для эффективного разделения. Если в определенной области хроматограммы пики выходили слишком плотно, градиент можно было сделать более пологим. Если же пики были чрезмерно растянуты, градиент можно было сделать более крутым. Таким образом удавалось создавать профили с локальными ускорениями и замедлениями изменения концентрации соли. Этот прибор выпускался в 1960-1970-х годах и послужил одним из прототипов систем формирования градиента в первых автоматических аминокислотных анализаторах. Градиенты сложной формы широко используются и сегодня. Однако сейчас их почти никогда не получают с помощью механических многокамерных устройств типа Varigrad. Вместо этого форму градиента программирует насосная система современных хроматографов. Профиль элюции разбивают на отдельные участки, для каждого из которых задают собственный локальный градиент, изменяя соотношение подаваемых буферов. Красота, которую мы потеряли!

Марии можно звонить даже ночью - если, конечно, вопрос по реагентам. Или информационая система в старые времена до этих ваших интернетов.

Пылесос против снега! Или необычное лабораторное применение привычных устройств (из порицаемой соцсети)

Краситель для гелей из аптечки Какие только удивительные рецепты не встретишь в старых книгах! Оказывается, антибиотик тетрациклин можно использовать для флуоресцентной детекции липопротеинов в гелях. Всего-то нужны немного тетрациклина, щепотка сульфата цинка - и липопротеины не останутся незамеченными. Кстати, у тетрациклина есть еще одно интересное свойство: он обладает высокой способностью связывать ионы кальция. Если тетрациклин попадает в организм во время формирования зубов, он включается в минерализующиеся ткани, образуя комплекс «тетрациклин-кальций-фосфат». В результате молекулы тетрациклина оказываются встроенными в дентин и эмаль. Сразу после включения в ткани тетрациклин обладает яркой желто-зеленой флуоресценцией под УФ-светом. А со временем под действием света и окисления происходит фотоокисление молекул, и окраска становится более темной - желтой, коричневой, серой или сине-серой. Именно поэтому тетрациклин не рекомендуют применять во время беременности и у детей младше 7–8 лет. Гугл и различные ИИ про возможность окраски липопротеинов в гелях практически ничего не знают. Иногда полезно заглядывать в старые книги - там порой встречаются весьма неожиданные и интересные методики! Энжойте! P.S. Еще один красителей для гелей из аптечки - зеленка. Но красить ей неудобно - нестойкая!

Будильник для сборщика фракций Какие только девайсы не придумывали до широкого распространения коллекторов фракций! На фото - устройство для того, чтобы будить студента при сборе фракции после колонки. Из книги Otakar Mikeš, Robert Alexander Chalmers Laboratory Handbook of Chromatographic Methods(1966). Оно состоит из коромысла на котором подвешен приемный сосуд, оттарированный на требуемый объем жидкости. По мере наполнения сосуда до этого объема коромысло наклоняется и замыкает электрический контакт. Включается сигнал - лампочка, звонок или удар током. Ни капли мимо!

Надо в Пущино запилить особую рюмочную, где целый день наливают бесплатно, если опубликуете статью в журнале "Природа".

Халатность в очистке, или первый в мире Ni-IDA халат Всем известны методы очистки рекомбинантных белков с гис-тэгом на IMAC-сорбентах на основе сефарозы или полиметакрилата. А как вам такое - чистить белки с помощью лабораторного халата? Конечно, сам по себе халат не сильно поможет в очистке, а вот если его модифицировать металлохелатными лигандами - это другое дело. Меня впечатлила история Руслана про использование для активации сефарозы обычного советского разбавителя эпоксидного клея с Ozon. Для активации нужен правильный русхимовский разбавитель - будьте внимательны, не все разбавители подходят. Нужен 1,4-диглицидиловый эфир бутандиола. Халат подходит строго из хлопчатобумажной ткани. По природе это целлюлоза, гидроксильные группы есть, можно активировать. Протокол получения халатного сорбента: 1. Найти хлопчатобумажный халат. 2. Отрезать лоскуток (~0,5 г) и прокипятить 15 мин в растворе карбоната натрия для удаления загрязнений. 3. Поместить лоскуток в раствор для активации: 20 мл 0,6 М NaOH, 2 мг/мл боргидрида натрия, 20 мл разбавителя для эпоксидного клея и 10 мл ДМСО. Это удобно делать в фальконе на 50 мл. 4. Хорошо встряхнуть и инкубировать на качалке 8 ч при комнатной температуре. 5. Слить раствор и тщательно промыть водой (5-6 смен воды). 6. Добавить 40 мл 0,5 М карбонат-бикарбонатного буфера pH 10 с 250 мг иминодиуксусной кислоты (IDA). Я довел pH раствора карбоната натрия башкирской содой, но можно и не доводить - будет pH ~11, что, вероятно, даже лучше. 7. Инкубировать на качалке 24 ч. 8. Тщательно отмыть водой. 9. Зарядить IDA-халат никелем или медью (подойдут любые водорастворимые соли, можно растворить на глаз). 10. Затем отмыть водой, 0,5 М NaCl и снова водой. 11. Вы великолепны - получили IDA-халат для IMAC! Для теста почистил GFP - Ni-IDA-халат работает! Емкость пока не очень высокая, есть что оптимизировать. Но начало хорошее. Еще один протокол для энциклопедии юных постапокалиптических сурков готов! Энжойте!

А ручки-то вот они! Одна большая компания указала на странице к своим антителам ссылку на статью. Только вот незадача - авторы в этой статье их антитела не использовали. Конфуз!

Презерватив 19 века это не только средство контрацепции Если вы поищите в PubMed статью, где впервые упоминается “condom”, вы найдете статью не о главном предназначении презерватива, а о том, что полезного можно из него сделать. В статье 1875 года американского врача H. Olis Hyatt «Fifteen Uses for the Indiarubber Condom» автор рассматривал его не как средство контрацепции, а как универсальный медицинский инструмент. Среди предложенных применений: -холодный или горячий компресс -остановка носовых кровотечений -ледяной мешок или грелка вдоль позвоночника -расширение уретры -влагалищный тампон -охлаждение влагалища -введение льда в матку при кровотечении -баллон для остановки послеродового кровотечения -расширитель шейки матки -охлаждение прямой кишки -остановка ректальных кровотечений -расширение стриктур прямой кишки -компрессионная терапия орхита -импровизированный шприц -расширитель хирургических ран Какие же крепкие презервативы были в 19 веке! Судя по описанию, прочность была на уровне резиновой грелки, богатыри - не мы! Причем в 1875 их еще производили вулканизацией листовой заготовки, то есть изделия были со швом. Бесшовная технология погружением стеклянной формы в жидкий латекс появилась только в 1880 в Германии. Самое интересное, что некоторые идеи автора опередили свое время. Современные баллонные катетеры, маточные баллоны для остановки кровотечений и дилататоры работают по тому же принципу: эластичная оболочка, которую можно раздуть жидкостью и использовать для давления на ткани.

Иммунодиффузия на форсаже! На фото не ядерный грибочек, а результат реакции иммунодиффузии, ускоренной электрическим полем - электроиммунодиффузии (EID). На фото - результат двумерной электроиммунодиффузии, когда антигены человеческой сыворотки разгоняются в агарозе вначале в одном направлении. Потом полоска вырезается и разгоняется во втором направлении в геле с лошадиной антисывороткой к человеческой сыворотке. Как пишет автор книги: The result is two-dimensional single EID, which can be as pleasing esthetically as scientifically. Понимаете, привлекательно не только с научной точки зрения, но и с эстетической! Куда без эстетики в нашем деле!

Когда резко понадобилось довести pH карбонатно-бикарбонатного буфера на помощь приходит простая советская сода из пятерочки.

Стабильный поток для хроматографии без насоса Когда нет насоса, буфер через колонку можно прокачивать самотеком. Нужно налить буфер в емкость, поместить ее над колонкой и соединить трубочкой со входом колонки. Одна проблема: по мере снижения уровня жидкости скорость потока уменьшается, потому что уменьшается гидростатический столб. Но это не проблема - на помощь придет сосуд Мариотта! Сосуд (или сифон) Мариотта - это герметично закрытая емкость с отводом на дне и длинной трубкой, соединенной с атмосферой и опущенной в жидкость. Когда жидкость начинает вытекать из емкости через выход, внутри создается разрежение. Воздух может попасть в систему только через длинную трубку, конец которой находится на определенной глубине в жидкости. Пока уровень жидкости выше конца этой трубки, давление в системе компенсируется таким образом, что гидростатический напор остается постоянным. Этот же принцип используется в некоторых устройствах для автополива растений. Стабильный поток - это воспроизводимое время удерживания и меньшее расплывание зон. А при работе с мягкими сорбентами колба Мариотта позволяет поддерживать постоянное давление без риска сжатия сорбента. Рекомендуется устанавливать трубочку так, чтобы ее конец находился на 2-3 см ниже поверхности жидкости. Если трубка опущена глубоко, скорость потока будет высокой, а если расположена почти у поверхности, вода может быстро вытечь и обнажить кончик трубки - система выйдет из режима постоянного гидростатического напора. Этот ныне почти забытый в хроматографии девайс можно сколхозить самостоятельно. Но раньше были и готовые решения. На фото - колба Мариотта из каталога легендарной фирмы Pharmacia. Причем интересно, что этот девайс два в одном: и упаковочная воронка, и устройство для прокачки при постоянном давлении. Если вам достался упаковочный адаптер Pharmacia, не спешите выбрасывать стеклянную трубку - это очень полезная деталь! Энжойте! Теперь вы знаете, как обеспечивать равномерный поток при хроматографии без электричества и насосов.