اکنون در دسترس! پژوهش تلگرام ۲۰۲۵ — مهمترین بینشهای سال 
Докторские байки
رفتن به کانال در Telegram
Разные истории из лабораторного мира. Старое лабораторное оборудование, олдскульные методики, лайфхаки и красивые картинки из лабораторий. Очистка белков, биохимия, молбиология и прочий хардкор. Связь с автором: @Rafil_Khairullin
نمایش بیشتر2 840
مشترکین
+124 ساعت
+67 روز
+2130 روز
در حال بارگیری داده...
کانالهای مشابه
ابر برچسبها
اشارات ورودی و خروجی
---
---
---
---
---
---
جذب مشترکین
ژوئن '26
ژوئن '26
+17
در 1 کانالها
مه '26
+78
در 9 کانالها
Get PRO
آوریل '26
+44
در 2 کانالها
Get PRO
مارس '26
+90
در 3 کانالها
Get PRO
فوریه '26
+73
در 1 کانالها
Get PRO
ژانویه '26
+89
در 6 کانالها
Get PRO
دسامبر '25
+363
در 3 کانالها
Get PRO
نوامبر '25
+136
در 5 کانالها
Get PRO
اکتبر '25
+84
در 5 کانالها
Get PRO
سپتامبر '25
+141
در 6 کانالها
Get PRO
اوت '25
+47
در 5 کانالها
Get PRO
ژوئیه '25
+73
در 2 کانالها
Get PRO
ژوئن '25
+63
در 4 کانالها
Get PRO
مه '25
+64
در 1 کانالها
Get PRO
آوریل '25
+248
در 7 کانالها
Get PRO
مارس '25
+78
در 2 کانالها
Get PRO
فوریه '25
+84
در 2 کانالها
Get PRO
ژانویه '25
+152
در 4 کانالها
Get PRO
دسامبر '24
+93
در 4 کانالها
Get PRO
نوامبر '24
+54
در 2 کانالها
Get PRO
اکتبر '24
+71
در 2 کانالها
Get PRO
سپتامبر '24
+151
در 5 کانالها
Get PRO
اوت '24
+76
در 3 کانالها
Get PRO
ژوئیه '24
+54
در 2 کانالها
Get PRO
ژوئن '24
+63
در 2 کانالها
Get PRO
مه '24
+115
در 4 کانالها
Get PRO
آوریل '24
+73
در 2 کانالها
Get PRO
مارس '24
+71
در 5 کانالها
Get PRO
فوریه '24
+73
در 4 کانالها
Get PRO
ژانویه '24
+87
در 2 کانالها
Get PRO
دسامبر '23
+102
در 3 کانالها
Get PRO
نوامبر '23
+38
در 3 کانالها
Get PRO
اکتبر '23
+97
در 2 کانالها
Get PRO
سپتامبر '23
+530
در 0 کانالها
| تاریخ | رشد مشترکین | اشارات | کانالها | |
| 13 ژوئن | +1 | |||
| 12 ژوئن | +2 | |||
| 11 ژوئن | +2 | |||
| 10 ژوئن | 0 | |||
| 09 ژوئن | +2 | |||
| 08 ژوئن | +2 | |||
| 07 ژوئن | 0 | |||
| 06 ژوئن | +1 | |||
| 05 ژوئن | +2 | |||
| 04 ژوئن | +3 | |||
| 03 ژوئن | +1 | |||
| 02 ژوئن | +1 | |||
| 01 ژوئن | 0 |
پستهای کانال
Шмерососы для молекулярных биологов Москвы
Московские власти решили усилить борьбу со шмерами на агарозных гелях и разработали "шмерососы".
Маленькие помощники помогут московским ученым получать чистые гели и получать результаты достойные журналов из белого списка ВАКа.
| 2 |  Алкалоиды в лучших аптеках города! | 881 |
| 3 | Упаковка реактивов до этих ваших сигм и олдричей! | 1 |
| 4 |  Будь со мной нежен vs да ладно, что ты
Обычно при очистке белков ученые вынуждены быть особенно внимательными к условиям очистки для того, чтобы избежать денатурации белков. Очистку проводят при охлаждении, подбирают pH и добавляют стабилизирующие растворы.
Но мир белков потрясающе разнообразен - и некоторые белки спокойно выдерживают жесткие условия, которые для большинства их полипептидных собратьев смертельны. Так и в случае адгезивных белков из моллюсков - в статье ученые используют для экстракции разбавленную хлорную кислоту, а для осаждения подкисленный ацетон. И ничего, белок живее всех живых!
Этот класс полифенольных белков (mussel adhesive proteins, MAPs) интересный пример природного клея - с помощью них мидии и прочие моллюски способны приклеиваться наже на мокрых поверхностях в море. А все дело в модификациях аминокислот, они богаты катехольными (полифенольными) группами, в первую очередь за счёт аминокислоты DOPA (3,4‑дигидроксифенилаланин). Эти модификации работают на трех уровнях: начальные нековалентные взаимодействия (адгезия), затем окисление до хинона и образование ковалентной сетки, и одновременно формирование металл‑катехольных координационных связей.
Теперь вы знаете, как в условиях пост-апокалипсиса получить клей для влажных поверхностей! Вам понадобятся мидии, хлорая кислота, ацетон и солянка. Энжойте! | 1 116 |
| 5 |  Актуальный вопрос | 1 944 |
| 6 | Как синтезировать аффинный сорбент. Эпокси активация матрицы
Продолжение постов про получение аффинных сорбентов (начало - тут).
Эпокси активация сефарозы - это классический способ активации , при котором на поверхности матрицы формируются эпоксигруппы, способные к ковалентному связыванию лигандов. Я активировал эпихлогидрином, простым и доступным эпокси-реагентом. Еще круче - активировать бис-оксиранами (1,4 -бутандиол диглицидиловый эфир), но он дороже. Руслан @Biophyschem рассказывал, что успешно использовал для активации технический 1,4 -бутандиол диглицидиловый эфир купленный на озоне - она используется как разбавитель эпоксидной смолы.
После активации на сефарозе появляются эпоксигруппы, которые могут реагировать с аминными, тиольными и гидроксильными группами лигандов, что делает метод универсальным по сравнению с CNBr. Если вы беспокоитесь о токсичности BrCN - эпоксиактивация отличная альтернатива.
Преимущества этого метода:
1. Менее токсичные реагенты, по сравнению с BrCN
2. Можно связывать не только по аминогруппам, но и по тиолам и даже гидроксилам (всего-то нужно поменять pH конъюгации)
3. По сравнению с BrCN активацией связь гораздо прочнее, практически отсутствует утечка лиганда. Проще повторно использовать.
4. Связь образуется через гидрофильный спейсер, в случае эпихлоргидрина это три атома углерода, если брать диглицидиловые эфиры -от 6 до 12!
5. Активированный сорбент можно хранить и использовать позднее.
6. Не остается заряженных групп.
Недостатки тоже есть:
1. Реакция иммобилизации происходит в щелочных условиях, не всем белкам может подойти
2. Активация проходит дольше
3. По моему опыту - как будто бы емкость получается ниже, чем в случае BrCN
4. Эпокси реагент помимо активациии сорбента может и участвует в кросс-сшивке, с уменьшением пористости микросфер.
Для проведения эпоксиактивации я использовал метод, описанный в статье Matsumoto (1979). В замечательной книге Hermanson на стр. 691 также есть протокол (но без DMSO и более долгий). Если кратко - сефарозу ресуспендируют в смеси 0,4M NaOH и DMSO, добавляют эпихлоргидрин и оставляют активироваться на 2 ч при температуре 40С. Потом остается только отмыть, добавить белок в щелочном буфере и проинкубировать. После конъюгации сорбент нужно отмыть и заблокировать оставшиеся эпокси группы и снова отмыть. Неиспользованный активированный сорбент можно хранить в воде с консервантами в холодильнике.
Энжойте и получайте аффинный сорбент просто! | 1 882 |
| 7 |  Самый первый гель
Слюнявчик с гелем - чтобы не облиться буфером! | 1 274 |
| 8 | Не храните долго раствор SDS!
Додецильсульфат натрия, или SDS, широко применяется в молекулярной биологии, особенно в электрофорезе в денатурирующих условиях (SDS‑PAGE).
Молекула SDS - это производное алифатического спирта (додеканола), в котором гидроксильная группа заменена на сульфатную через эфирную связь. Со временем эта эфирная связь может разрываться. В результате образуются спирт додеканол, который плохо растворим в воде, и серная кислота или сульфат‑ион (в зависимости от pH). Раствор при этом закисляется, может выпасть осадок. В целом SDS при нейтральном pH довольно стабилен, но в кислых или основных условиях и при нагреве распад ускоряется.
С сухим порошком, кстати, гидролиз также может происходить - из‑за гигроскопичности сульфатной группы. Эта реакция является автокаталитической: при гидролизе выделяются ионы водорода, которые ускоряют дальнейший гидролиз.
Отсюда важные выводы:
1. При сомнениях в свежести проверяйте pH - свежеприготовленный 1% раствор SDS имеет pH ~6.5. Если раствор хранился несколько лет, pH может упасть до 3.5-2.5.
2. Сухой порошок храните герметично закрытым, желательно запарафильмить. Очень старый SDS, с советских времен, перед использованием лучше проверить.
Энжойте и следите за своим SDS! | 1 496 |
| 9 |  С международным днем химика!
"Нельзя смотреть на лабораторию, все равно какую, учебную ли, производственную ли или экспериментальную, как на какое-то временное местопребывание. Всякая лаборатория — пусть даже химик находится в ней временно — должна быть близкой, родной"
Из "Техники лабораторных работ" Воскресенского, второе издание, 1937 год. В более поздних изданиях эта нежность была потеряна, сплошной канцеляризм. | 1 547 |
| 10 |  Когда лень гонять реальный блот
Ну что все так ополчились на Термо. Фотошопные картинки не обязательно свидетельствуют, что антитела не работают. Может термовцем было просто лень блот гонять?
Как у Даниила Хармса:
“…Выходит маленькая девочка.
М а л е н ь к а я д е в о ч к а:
- Папа просил передать вам всем, что театр закрывается. Нас всех тошнит” | 1 648 |
| 11 |  Не выбрасывайте пенку из бульона!
В кулинарной книге Л.И. Словцовой “Здоровый стол” (1930) настостельно рекомендуется не уподобляться французам и не выбрасывать пену из супа.
Ведь пища - не удовольствие, а удовлетворение насщных потребностей тела.
Каждый грамм белка ценен! | 1 764 |
| 12 | Гордость и предубеждение и белок мочи
В 2010 году ученые открыли белок в моче мышей, который притягивает самок к запаху конкретного самца. И назвали этот феромон Darcin - в честь мистера Дарси, героя романа Джейн Остин «Гордость и предубеждение», от которого теряет голову героиня. Интересно, что этот белок не просто привлекает - он напрямую влияет на выбор партнера. | 1 962 |
| 13 |  Бывают студенты суперумные, а бывают суперсильные | 1 996 |
| 14 |  Главное - как акценты расставить! Стоит много денег? Да! Дорого ли? Конечно нет! | 2 009 |
| 15 | Как синтезировать аффинный сорбент. Активация матрицы
Для ковалентной иммобилизации белков матрицу необходимо предварительно активировать. Методов активации очень много, подробнее можете почитать в рекомендованных книгах (+ Остреман). Ниже приведены основные принципы и практические моменты для метода активации бромцианом, без избыточной детализации условий реакции. Материал предназначен только для специалистов и носит ознакомительный характер. Буду рад, если в комментариях поделитесь своими лайфхаками и советами про активацию сорбентов.
Активация бромцианом
CNBr активация сефарозы является классическим быстрым методом, разработанным в 1960х годах сотрудниками компании Pharmacia. В щелочной среде бромциан реагирует с -OH группами агарозы и образует реакционноспособные промежуточные структуры, преимущественно эфиры цианатов и производные имидакарбоната. Эти группы легко взаимодействуют с аминогруппами белков, в результате чего формируется ковалентная связь. Метод отличается высокой скоростью и удобством, однако имеет ряд ограничений: используется токсичный реагент, активированные группы нестабильны и должны использоваться сразу после получения, формируемая связь может вносить дополнительный положительный заряд, а сама реакция не является строго сайт специфичной, что иногда влияет на активность белка. Изомочевинная связь нестабильно при низких pH и со временем колонка начинает подтекать (после эпокси-активации связь гораздо стабильнее).
Важно! Соблюдайте технику безопасности! Все операции с бромцианом проводят строго в вытяжном шкафу, так как реагент токсичен и летуч. Растворы после реакции также остаются токсичными. Для их нейтрализации и обработки посуды используют щелочной раствор с добавлением сернокислого железа, например 0.5 M Na2CO3 с добавлением примерно 50 мМ FeSO4, выдерживая около 15 минут.
На практике сефарозу ресуспендируют в холодном буфере с высоким pH. Буфер следует выбирать без аминогрупп. Перемешивание предпочтительно проводить с использованием верхнеприводной мешалки, так как мешальник магнитной мешалки может механически разрушать гранулы матрицы. Для активации требуется pH порядка 9-10 и охлаждение. В ряде работ рекомендуют контролировать pH с помощью pH метра и корректировать его щелочью, однако более удобным является использование концентрированного карбонатного буфера. Например, в работе March (1974) предложено проводить реакцию в 2 M растворе карбоната натрия, который обеспечивает достаточно высокий pH и буферную емкость без необходимости постоянного контроля. В таких условиях к сефарозе добавляют реагент для активации и проводят активацию в течение 1-2 минут. После этого матрицу быстро переносят на фильтр Шотта и последовательно промывают холодным щелочным буфером, водой и буфером, предназначенным для последующей коньюгации. Сефарозу слегка подсушивают на фильтре, затем переносят в подходящую пробирку, добавляют белок в буфере и проводят иммобилизацию при перемешивании при +4 C в течение нескольких часов, часто оставляя на ночь. После завершения реакции сорбент тщательно отмывают и оценивают эффективность иммобилизации.Далее блокируют оставшиеся активные центры и все, можно работать!
Важные моменты
1. Стандартные лопатки мешалок часто слишком велики для небольших объемов, поэтому удобно изготовить компактный вариант,например из пластикового шпателя Дригальского.
2. Охлаждать можно, добавляя лед в реакционную смесь (при больших объемах).
3. Дин (1988) указывает, что Трис использовать можно, так как аминогруппа экранирована.
4. Бромциан лучше вводить в виде раствора в ацетонитриле, что повышает воспроизводимость и удобство работы; такой раствор можно хранить при температуре около -70 C. Для оценки эффективности иммобилизации можно использовать качественное окрашивание кумасси, а также количественные подходы, например измерение оптической плотности суспензии в глицерине. Часто применяют оценку по содержанию несвязавшегося белка в супернатанте и промывках, однако этот метод не всегда дает точную картину.
5. Блокировать можно глицином, этаноламином, гидроксиламином. | 1 894 |
| 16 | Какой метод активации сорбента используете? | 1 552 |
| 17 | Как синтезировать аффинный сорбент. Матрица
Матрица – то, к чему будет пришиваться белок.
Спектр твердых фаз для иммобилизации довольно широкий. Это могут быть не только хроматографические сорбенты, но и фильтровальная бумага, стеклянные шарики, силикагель, лунки полистирольных планшетов и т.д. Но для очистки белков самый удобный вариант - модификация хроматографического сорбента.
На мой взгляд, самый универсальный вариант - это сефароза (агароза). Это полисахаридная матрица, достаточно жесткая, химически устойчивая, с хорошими потоковыми характеристиками. А самое главное - в сефарозе много гидроксильных групп, которые несложно модифицировать. Для активации подходит как обычная сефароза, так и кросс-сшитая (CL, cross-linked). Существуют предактивированные матрицы, но, на мой взгляд, это избыточно - все достаточно просто сделать в лаборатории.
Другой вариант - целлюлозные матрицы. Их также удобно модифицировать по гидроксильным группам, но физико-химические свойства уступают сефарозе. Пористость целлюлозных матриц значительно ниже, они хуже выдерживают давление и работают медленнее. Биологическая устойчивость также ниже. Однако они дешевле и доступнее, поэтому могут использоваться для разовых решений. Рассматривать их как основу имеет смысл только при отсутствии сефарозы.
Полиакриламидные матрицы по механической стабильности и устойчивости к микробной деградации превосходят сефарозу. Их важное преимущество - отсутствие проблемы взаимодействия с сахар-связывающими белками (например, лектинами). Однако самостоятельно модифицировать полиакриламидную матрицу существенно сложнее. Амидные группы плохо поддаются активации, а методы их модификации часто требуют жестких условий, которые могут частично разрушать матрицу, а также использования реагентов, которые сложнее достать. Поэтому в производстве активные группы обычно вводят еще на стадии синтеза матрицы. В обычной лаборатории работать с такими матрицами менее удобно. При этом существуют готовые решения, например Profinity Epoxide Resin от Bio-Rad, позволяющие реализовать преимущества полиакриламидной основы.
Итак, если суммировать: при необходимости получения аффинного сорбента оптимальным выбором в большинстве случаев является сефароза. Наиболее распространенные варианты - Sepharose 4B и Sepharose 6B, а также их кросс-сшитые версии - Sepharose 4B CL и Sepharose 6B CL (CL, cross-linked). Sepharose 4B более пористая (предел исключения около 20 МДа), но менее прочная.
Sepharose 6B менее пористая (предел исключения около 4 МДа), но механически более устойчива. Для крупных объектов, таких как IgM, вирусы, предпочтительнее использовать 4B. Для белков среднего размера чаще выбирают 6B. В кросс-сшитых вариантах часть гидроксильных групп задействована в формировании сшивок, поэтому теоретическая емкость может быть немного. Однако на практике это редко является критичным, в то время как механическая прочность и жесткость существенно возрастают. Поэтому для работы при повышенных потоках или в хроматографических системах предпочтительнее использовать CL-версии. Еще более устойчивым вариантом являются Fast Flow версии сефарозы - они обладают повышенной жесткостью и лучше подходят для работы при высоких скоростях потока.
Теперь вы знаете как выбирать матрицу. В следующем посте расскажу про методы активации. | 1 558 |
| 18 |  Она все-таки крутится!
Удивительно, но центрифуги с ручным приводом все еще производятся и продаются!
На фото - ручная центрифуга фирмы Hettich (студенты в комплект не входят). | 2 304 |
| 19 |  Как получить аффинный сорбент
Аффинная хроматография - это эффективный метод очистки белков, основанный на специфическом сродстве белка и закрепленного на носителе (матрице) лиганда.
Часть аффинных сорбентов доступна коммерчески, но довольно часто нужный сорбент невозможно купить, и его приходится синтезировать самостоятельно.
Существует много интересных подходов разной степени сложности. Не все из них легко реализовать в обычной лаборатории. В серии постов расскажу общий подход к иммобилизации белков на сорбенте в условиях стандартной молбио/биохимической лабы.
Самый простой способ получить аффинный сорбент - использовать коммерческие предактивированные матрицы. Они удобны в работе, безопасны и часто дают более высокую емкость по сравнению с самодельными вариантами. Обычно активная группа соединена с матрицей через спейсер, что снижает стерические ограничения при связывании таргетного белка. Сама процедура иммобилизации максимально простая: как правило, достаточно добавить белок в подходящем буфере и подождать. Но, конечно, такой подход заметно дороже самодельных решений.
Если вам ближе путь самурая, вот несколько книг, которые я рекомендую тем, кто хочет разобраться в синтезе аффинных сорбентов:
1. Greg T. Hermanson. Bioconjugate Techniques. Безусловный номер один. Подробнее про нее тут.
2. David M. Jameson, Shan S. Wong. Chemistry of Protein and Nucleic Acid Cross-Linking and Conjugation (2012). Больше внимания уделено химии процессов, хорошая книга.
3. Дин П. Аффинная хроматография. Методы (1988). Перевод на русский, хрошая книга с разбором классических методов активации и даже описанием получения самих сорбентов. | 2 167 |
| 20 |  Когда шейкер без охлаждения - помогут атланты! | 2 086 |
