Докторские байки
رفتن به کانال در Telegram
Разные истории из лабораторного мира. Старое лабораторное оборудование, олдскульные методики, лайфхаки и красивые картинки из лабораторий. Очистка белков, биохимия, молбиология и прочий хардкор. Связь с автором: @Rafil_Khairullin
نمایش بیشتر2 978
مشترکین
اطلاعاتی وجود ندارد24 ساعت
+87 روز
+2030 روز
در حال بارگیری داده...
کانال‌های مشابه
ابر برچسب‌ها
اشارات ورودی و خروجی
---
---
---
---
---
---
جذب مشترکین
اکتبر '26اکتبر '26
اکتبر '26
+13
در 4 کانال‌ها
سپتامبر '26
+52
در 5 کانال‌ها
Get PRO
اوت '26
+61
در 5 کانال‌ها
Get PRO
ژوئیه '26
+69
در 4 کانال‌ها
Get PRO
ژوئن '26
+54
در 6 کانال‌ها
Get PRO
مه '26
+78
در 11 کانال‌ها
Get PRO
آوریل '26
+44
در 3 کانال‌ها
Get PRO
مارس '26
+90
در 4 کانال‌ها
Get PRO
فوریه '26
+73
در 4 کانال‌ها
Get PRO
ژانویه '26
+89
در 7 کانال‌ها
Get PRO
دسامبر '25
+363
در 4 کانال‌ها
Get PRO
نوامبر '25
+136
در 6 کانال‌ها
Get PRO
اکتبر '25
+84
در 6 کانال‌ها
Get PRO
سپتامبر '25
+141
در 6 کانال‌ها
Get PRO
اوت '25
+47
در 6 کانال‌ها
Get PRO
ژوئیه '25
+73
در 2 کانال‌ها
Get PRO
ژوئن '25
+63
در 4 کانال‌ها
Get PRO
مه '25
+64
در 1 کانال‌ها
Get PRO
آوریل '25
+248
در 7 کانال‌ها
Get PRO
مارس '25
+78
در 2 کانال‌ها
Get PRO
فوریه '25
+84
در 2 کانال‌ها
Get PRO
ژانویه '25
+152
در 4 کانال‌ها
Get PRO
دسامبر '24
+93
در 4 کانال‌ها
Get PRO
نوامبر '24
+54
در 2 کانال‌ها
Get PRO
اکتبر '24
+71
در 2 کانال‌ها
Get PRO
سپتامبر '24
+151
در 5 کانال‌ها
Get PRO
اوت '24
+76
در 3 کانال‌ها
Get PRO
ژوئیه '24
+54
در 2 کانال‌ها
Get PRO
ژوئن '24
+63
در 2 کانال‌ها
Get PRO
مه '24
+115
در 4 کانال‌ها
Get PRO
آوریل '24
+73
در 2 کانال‌ها
Get PRO
مارس '24
+71
در 5 کانال‌ها
Get PRO
فوریه '24
+73
در 4 کانال‌ها
Get PRO
ژانویه '24
+87
در 2 کانال‌ها
Get PRO
دسامبر '23
+102
در 3 کانال‌ها
Get PRO
نوامبر '23
+38
در 3 کانال‌ها
Get PRO
اکتبر '23
+97
در 2 کانال‌ها
Get PRO
سپتامبر '23
+530
در 0 کانال‌ها
| تاریخ | رشد مشترکین | اشارات | کانال‌ها | |
| 09 اکتبر | +6 | |||
| 08 اکتبر | +2 | |||
| 07 اکتبر | +1 | |||
| 06 اکتبر | 0 | |||
| 05 اکتبر | +2 | |||
| 04 اکتبر | 0 | |||
| 03 اکتبر | +1 | |||
| 02 اکتبر | +1 | |||
| 01 اکتبر | 0 |
پست‌های کانال
+5
А вот так выглядит процесс упаковки колонок. В основном ГФ, для ионообменки обычно так не заморачивался.
| 2 |  Большой стране - большие упаковочные воронки!
При упаковке колонок в простейших случаях для хроматографии самотеком (gravity flow) можно просто налить в колонку суспензию сорбента, дать частицам осесть - и колонка готова.
Если планируется использовать колонку при среднем давлении, упаковка немного сложнее: для равномерного заполнения лучше залить суспензию сорбента сразу, а не порциями (хотя для некоторых применений порционная загрузка тоже работает), и вести упаковку в потоке.
Для того чтобы вместить весь объем суспензии, колонку следует удлинить специальным упаковочным резервуаром. Иногда для этого используют специальные воронки с резьбой, которые прикручиваются к верхней части колонки, а иногда колонку соединяют с тушкой еще одной колонки через муфту.
Дополнительный резервуар позволяет вместить весь объем суспензии и, как правило, имеет резьбовое соединение, которое позволяет подключить поток от насоса. Если планируете самостоятельно набивать гель-фильтрационные колонки сложнее, чем колонки для обессоливания, то без упаковочной воронки никак.
На фото слева - две воронки легендарной фирмы Pharmacia для XK-колонок диаметром 16 и 26 мм, крайняя справа - воронка Cytiva для 50 мм колонки. А посередке - копии воронок Cytiva для колонок XK 26 и XK 50. На удивление, выглядят прилично. Осталось протестить! | 730 |
| 3 |  Спирт - в ультразвук!
Еще одна история, про которую узнаешь только при личном общении.
В Казани в середине 1990х годов в СПИД-центре активно разрабатывались и внедрялись в практику новые тест-системы. Старшие коллеги рассказывали, что сами в противогазах выделяли пероксидазу, получали антитела, делали конъюгаты, нарабатывали антигены и выпускали ИФА тест-системы.
Среди всех этих биохимических работ появлялись и удивительные открытия. Например, обнаружили, что если 43% этанол обработать ультразвуком, то такая импровизированная водка становилась мягче и не давала головной боли поутру. Контрольные эксперименты, само собой, тоже проводили.
Обработку выполняли на УЗДН-2 на максимальной мощности, пока спирт не становился мутным из-за пузырьков. Занимало это около двух минут. Затем спирт снова становился прозрачным и приобретал почти волшебные свойства.
Как это работало, непонятно: то ли из-за локального высокого давления при кавитации что-то менялось в составе, то ли образовывались свободные радикалы и влияли на вкус и свойства раствора. Но, по словам коллег, вкус и побочные эффекты спирта действительно менялись.
Впрочем, незнание механизмов никак не мешало практическому применению. Такая водка пользовалась большой популярностью в коллективе.
Так что, если хотите разнообразить алкогольные напитки, вот еще один способ. Энжойте умеренно! | 1 125 |
| 4 |  Шестигранник доберется до труднодоступных мест!
После сушки на роторном испарителе обычным шпателем бывает сложно соскоблить со стенок колбы весь продукт. Особенно трудно добраться до участков возле горлышка. Конечно, можно согнуть шпатель, но он ведь потом еще понадобится для других задач.
Когда я синтезировал Ni-NTA-сефарозу, промежуточный продукт нужно было полностью перенести из колбы. А подходящих шпателей, как назло, под рукой не оказалось. На помощь пришел простой советский шестигранный ключ, который позволил соскоблить продукт даже из самых труднодоступных мест колбы. | 1 176 |
| 5 |  Чумовые истории
Есть две интересные книги воспоминаний о разработке биологического оружия в СССР. Они написаны непосредственными участниками тех событий - Игорем Домарадским и Канатжаном Алибековым.
Игорь Домарадский "Перевертыш" (1995)
Автобиографическое произведение об ученых и научной среде того времени, взаимоотношениях между академической наукой, медициной и военными ведомствами. Автор рассказывает о работе советской противочумной системы, участии в проектах, связанных с советской военно-биологической программой и системой "Биопрепарат".
Домарадский много говорит о хаосе, бюрократии и внутренних противоречиях, которые мешали заниматься наукой. При этом он с большим уважением пишет об ученых-эпидемиологах и противочумной системе. Не случайно в книге есть отдельная глава с характерным названием: «А все-таки противочумная система лучше!».
Канатжан Алибеков "Осторожно! Биологическое оружие!"
(русское издание вышло в 2003 году)
С разу скажу: в этой книге заметна авторская позиция. Алибеков был первым заместителем начальника Главного управления «Биопрепарат». А в 1992 году перебрался в США и нагнать страху перед советским билогическим оружием было в его интересах. Что он успешно и делал, это чувствуется и в книге. Тем не менее ее очень интересно читать как взгляд высокопоставленного руководителя на то, как СССР создал огромную военно-биологическую систему, существовавшую параллельно официальной гражданской науке.
Советская программа биологического оружия была официально прекращена после распада СССР, однако от нее осталось значительное наследие. Многие биотехнологические предприятия, исследовательские центры и производственные площадки ведут свою историю именно от системы "Биопрепарат".
Прикрепляю в первом комменте книги в формате FB2. Энжойте! | 1 604 |
| 6 | +1 Alibekov_Ostorozhno-Biologicheskoe-oruzhie.fb2 | 4 |
| 7 | بدون متن... | 1 |
| 8 | Чумовые истории
Есть две интересные книги воспоминаний о разработке биологического оружия в СССР. Они написаны непосредственными участниками тех событий - Игорем Домарадским и Канатжаном Алибековым.
Игорь Домарадский "Перевертыш" (1995)
Автобиографическое произведение об ученых и научной среде того времени, взаимоотношениях между академической наукой, медициной и военными ведомствами. Автор рассказывает о работе советской противочумной системы, участии в проектах, связанных с советской военно-биологической программой и системой "Биопрепарат".
Домарадский много говорит о хаосе, бюрократии и внутренних противоречиях, которые мешали заниматься наукой. При этом он с большим уважением пишет об ученых-эпидемиологах и противочумной системе. Не случайно в книге есть отдельная глава с характерным названием: «А все-таки противочумная система лучше!».
Канатжан Алибеков "Осторожно! Биологическое оружие!"
(русское издание вышло в 2003 году)
С разу скажу: в этой книге заметна авторская позиция. Алибеков был первым заместителем начальника Главного управления «Биопрепарат». А в 1992 году перебрался в США и нагнать страху перед советским билогическим оружием было в его интересах. Что он успешно и делал, это чувствуется и в книге. Тем не менее ее очень интересно читать как взгляд высокопоставленного руководителя на то, как СССР создал огромную военно-биологическую систему, существовавшую параллельно официальной гражданской науке.
Советская программа биологического оружия была официально прекращена после распада СССР, однако от нее осталось значительное наследие. Многие биотехнологические предприятия, исследовательские центры и производственные площадки ведут свою историю именно от системы "Биопрепарат".
Прикрепляю книги в формате FB2. Энжойте! | 5 |
| 9 | Глыба белка или аффинный сорбент без носителя
Для очистки специфических антител можно ковалентно иммобилизовать антиген на частицах сорбента и получить аффинный сорбент. О методах активации я рассказывал ранее тут и тут. Такой подход сейчас является самым распространенным и хорошо отработанным.
Но в давние времена, до появления удобных сефарозных носителей, практиковали другой способ - превратить в аффинный сорбент сам антиген!
Для этого нужно было перевести белок в нерастворимое состояние, сохранив способность специфически связывать антитела. Одним из самых популярных способов была полимеризация белка глутаровым альдегидом. В статье S. Avrameas (1969) авторы тщательно протестировали влияние условий реакции на разные белки для получения аффинных сорбентов непосредственно из белковых препаратов. Такие частицы не разваливаются в мочевине или в SDS и их можно использовать для хроматографии.
Основные выводы:
1. pH реакции лучше всего выбирать вблизи pI белка.
2. Хорошая отправная точка: 5-10 мг глутарового альдегида на 100 мг белка.
3. Концентрация белка имеет значение - лучше использовать концентрированные растворы (20-50 мг/мл).
4. После образования геля реакционную смесь стоит инкубировать еще 1-3 часа.
5. Некоторые белки плохо сшиваются из-за малого количества доступных аминогрупп. В таких случаях помогает добавление БСА.
Такие аффинные сорбенты можно применять в объеме (batch): измельчить, отмыть и смешать с иммунной сывороткой, затем осадить, снова отмыть и элюировать связавшиеся антитела. А можно организовать и настоящую колоночную очистку! Небольшой недостаток - процесс очистки занимал 6-8 часов, дольше, чем на современных носителях. Но в статьях тех лет отмечается, что чистота получаемых препаратов антител была высокой, а сорбент можно было использовать повторно.
Так что если в постапокалипсисе в пустошах закончится сефароза, аффинный сорбент можно будет сделать и без нее!
Энжойте!
P.S. Прикрепляю протокол по получению аффинного сорбента из книги "Иммуносорбенты в очистке белка" 1979 | 2 037 |
| 10 |  Время набивать колонки!
На самом деле, это фотка из завода по производству оконного стекла. Вначале выдували в форме цилиндров, потом разрезали и распрямляли. | 1 729 |
| 11 |  Бредный ацетилхолин
Или когда в Чехословакии заканчивался запас букв "В". | 1 841 |
| 12 |  И еще про хромку
Когда только начал работать в аспирантуре, готовил хромпик с аспирантским максимализмом. Растворял дихромат калия в горячей серной кислоте, чтобы было поядреннее. Так хромпик получался мощнее, но уж больно напряжно его готовить по этому методу.
А потом подуспокоился и перешел на гораздо более простой способ. Надо взять грамм 25 порошка, насыпать в фарфоровый стакан, добавить ~50-100 мл воды и подрастворить. А потом добавить пол-литра серной кислоты. Да, получается менее концентрированный раствор. Но зато готовить гораздо проще, и все равно отлично работает!
Энжойте и готовьте хромпик проще! | 2 088 |
| 13 |  Уреазу - в школы!
Canavalia ensiformis ака Jack beans это ценный источник полезных белков! Помимо конканавалина А в ней содержится большое количество уреазы, суперспецифичного фермента, расщепляющего мочевину. Именно уреаза стала первым ферментом, полученным в кристаллическом виде.
На заре развития иммуноферментных методов уреазу рассматривали в качестве ферментативной метки наряду со щелочной фосфатазой и пероксидазой:
1) Уреаза очень активный фермент. Даже небольшое количество способно вызвать значительное изменение pH.
2) Высокая специфичность к мочевине. Можно обойтись без потенциально опасных субстратов - безопасно
3) Уреазная активность в биологических объектах встречается реже, чем, например, пероксидазная, поэтому вероятность неспецифического сигнала ниже.
4) Уреаза обладает высокой стабильностью при хранении и не ингибируется азидом натрия - проще хранить
5) Результат реакции можно визуализировать с помощью кислотно-основных индикаторов и наблюдать невооруженным глазом.
6) Изменение pH происходит постепенно, поэтому чувствительность можно повысить за счет увеличения времени инкубации.
Но есть и недостатки, из-за которых эта метка в конечном итоге проиграла пероксидазе:
1) Медленное развитие сигнала. Детекция происходит не напрямую, как в случае с пероксидазой, где субстрат сразу меняет цвет, а опосредованно через изменение pH среды.
2) Сильная зависимость от буферной емкости раствора. Слишком сильный буфер замедляет накопление сигнала.
3) Ограниченный выбор методов детекции. В основном используются хромогенные индикаторы. Хемилюминесцентные системы для уреазы почти не применяются.
4) Уреаза является никель-зависимым ферментом и может ингибироваться некоторыми ионами металлов и хелаторами.
Тем не менее, хотя для классического ИФА уреаза уступает пероксидазе, благодаря своей стабильности, дешевизне, простоте субстрата и безопасности она является очень удобной меткой для образовательных и демонстрационных экспериментов.
Я давно думаю о том, чтобы сделать ИФА-набор для школьных опытов. Нужно лишь очистить уреазу и конъюгировать ее со вторичными антителами. В качестве субстрата можно использовать дешевую мочевину. Изменение pH легко регистрировать недорогим индикатором, например бромкрезоловым пурпурным. По мере протекания реакции окраска будет меняться от желтоватой до красивой пурпурно-фиолетовой. Чем больше связанного с первичными антителами конъюгата уреазы, тем интенсивнее будет цвет.
Уреазу можно получать также из сои и арбузных семечек, однако в семенах C.ensiformis ее значительно больше. Так что сейчас, когда на маркетплейсах стало гораздо проще приобрести семена канавалии разработка такого учебного набора выглядит вполне реалистичной задачей. Осталось только найти время! | 2 129 |
| 14 | Лучшее - враг хорошего
В университете и в аспирантуре я зачитывался замечательной книгой Воскресенского «Техника лабораторных работ». Особенно мне нравился раздел про мытье лабораторной посуды. Там автор описывал разные ядреные смеси, и, конечно, хотелось все перепробовать.
На обычной хромке, даже горячей, я решил не останавливаться и захотел протестировать суперсмесь. В книге Воскресенский описывал два варианта: азотная кислота + дихромат калия и серная кислота + марганцовка.
Но что-то у меня перемкнуло: я все перепутал и приготовил смесь марганцовки в азотной кислоте. Растворил марганцовку в азотной кислоте, залил этой смесью кюветы... и получил великолепный бурый налет оксида марганца на стенках.
Потом пришлось отмачивать все это в щавелевой кислоте. После этого я решил больше не экспериментировать и пользоваться простой советской хромкой. | 1 488 |
| 15 |  Наука и вебкам | 1 924 |
| 16 | Сефадекс как аффинный сорбент
Удивительное - рядом! Сорбенты семейства сефадекс (Sephadex) производства легендарной фирмы Pharmacia чаще всего используются для гельфильтрации - разделение биомолекул по размеру. Есть и ионообменные сефадексы (Sephadex A50/A25 С50/С25) - но их сейчас применяют значительно реже.
Но, оказывается, сефадекс G50 можно использовать и для аффинной очистки важного для хроматографии гликопротеинов лектина - конкавалина А! Причем без всякой модификации. Сефадекс - это кросс-сшитый полимер декстрана и практически целиком состоит из множества остатков альфа-D-глюкозы. А конкавалин А способен специфически связывать остатки альфа-D-глюкозы и альфа-D-маннозы.
Получают конканавалин А (ConA) из семян растения Canavalia ensiformis (Jack bean). Значит, для очистки конкавалина А нужно всего лишь экстрагировать белок из порошка семян, осадить сульфатом аммония и дочистить на сефадексе G50.
А конкавалин А в хозяйстве очень полезный белок - если пришить его к носителю можно получить аффинный сорбент для очистки гликопротеинов.
На озоне с появлением китайских продавцов, наконец, стали доступны семена Canavalia ensiformis. Теперь добывать конкавалин А стало еще проще!
P.S. Прикрепляю описание очистки из замечательной книги Tijssen, P. (1985) Practice and theory of enzyme immunoassays. | 2 860 |
| 17 |  Самый горячий тиофен | 2 763 |
| 18 |  Вся очистка - в таблице
При очистке белков обычно ведут таблицу очистки, которая позволяет оценить эффективность каждого этапа по выходу, чистоте и степени обогащения целевого белка. К сожалению, во многих дипломных работах и даже диссертациях, где описана очистка белков, такие таблицы не приводятся.
Какие параметры указывают в таблице очистки ферментов или белков с измеряемой биологической активностью:
Объем раствора.
Общий белок. Его можно определить колориметрическими методами: Лоури, Брэдфорд, BCA-assay. Определение концентрации по A280 на начальных этапах очистки нецелесообразно, поскольку присутствует слишком много мешающих компонентов.
Общая активность. Для ферментов активность измеряют в единицах активности. Для некоторых ферментов можно сразу определить и количество активного белка. Например, для трипсина можно провести титрование активного центра и установить зависимость между активностью и количеством трипсина.
Если белок обладает измеряемой биологической активностью, ее выражают в биологических единицах активности, основанных на функциональном тесте (EC50, IC50, биологическая активность, нейтрализующая активность).
Удельная активность. Это самый важный показатель степени очистки фермента. Рассчитывается как отношение общей активности к общему количеству белка. Чем выше удельная активность, тем чище препарат.
Выход, %. Показывает, какая доля целевого белка сохранилась после данного этапа очистки. Рассчитывается как отношение общей активности на данном этапе к общей активности исходного лизата.
Степень очистки. Показывает, во сколько раз увеличилась удельная активность по сравнению с исходным материалом.
Таблицу очистки проще строить, если белок обладает какой-либо биологической активностью. Но если белок не является ферментом и не проявляет измеримую активность, классическая колонка «удельная активность» уже теряет смысл. В этом случае вместо параметров активности используют показатели чистоты.
Самый простой и распространенный способ определения чистоты — денситометрия SDS-PAGE гелей (в Bio-Rad Image Lab это делается очень просто). Также можно использовать капиллярный электрофорез или ВЭЖХ (HPLC).
Таблица очистки является аналогом баланса материального потока в химической технологии. Такая таблица позволяет оценивать эффективность отдельных стадий и всего протокола в целом, выявлять узкие места, сравнивать различные протоколы и оценивать воспроизводимость методики.
Энжойте и чистите белочки эффективно и воспроизводимо! | 3 701 |
| 19 |  Все мы знаем, для чего на самом деле нужен новый айфон! | 2 270 |
| 20 | Водка без лабы - деньги на ветер!
Водка в лабе - вещь полезная, и для банкета, и для отмывки гелей годится.
А в ТГ канале Лаба дорогого брата автор поделился опытом, как они использовали водку в качестве реакционной среды. Что добру продпадать! | 2 255 |
