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RNA-guia (Single guide RNA). Para que Cas9 possa executar sua função, ela precisa ser ativada e direcionada ao seu alvo. No processo de imunidade natural em bactérias, estas etapas são mediadas por duas moléculas de RNA que atuam cooperativamente: o crRNA (CRISPR-derived RNA) e tracrRNA (trans-activating RNA).

Com base nesse mecanismo natural foi desenvolvida a técnica de CRISPR. Para o entendimento do papel das moléculas envolvidas nessa tecnologia, deve-se levar em consideração a plasticidade dos ácidos nucleicos em se dobrarem, formando estruturas secundárias, e interagirem entre si, nas seguintes formas: (i) DNA:DNA, (ii) RNA:RNA e (iii) DNA:RNA. Adicionalmente, o DNA e (ou) RNA podem se associar com outras classes de moléculas, como as proteínas. Basicamente, a técnica de CRISPR envolve três moléculas: uma nuclease (geralmente a Cas9 tipo selvagem de Streptococcus pyogenes), um RNA-guia (conhecido como single guideRNA) e o alvo (frequentemente o DNA).

Na natureza, CRISPR-Cas é um sistema procariótico de imunidade baseado na captura e inserção de pequenos pedaços de DNA advindos da invasão por vírus ou plasmídeos, que são incorporados ao genoma da bactéria e contra os quais ela então adquire resistência (Horvath e Barrangou 2010).

Visão geral sobre moléculas envolvidas e mecanismos básicos de ação.

Quando avançarmos um pouco mais, vc terá o suficiente para que a verdade faça o seu trabalho. Apenas tenha calma.

Ainda que tudo te pareça confuso, não desanime, fique atento

Ninguém imaginava que a modesta descoberta do loco CRISPR poderia desencadear uma revolucão na genética molecular décadas mais tarde. Nos últimos anos, pesquisas mostraram que Cas9 é a principal nuclease envolvida no processo de clivagem de DNA invasor, resultando na utilização do sistema CRISPR como uma ferramenta fantástica de engenharia genética. Isto tornou possível editar com sucesso o genoma de células de mamíferos, assim como de inúmeros outros sistemas modelos (Hatoum-Aslan A e Marraffini LA, 2014; Jiang e Marraffini, 2015).

Nesse sentido, CRISPR é mais do que uma técnica de edição genética.

Frequentemente CRISPR é referida como uma técnica de edição genética, isto é, capaz de alterar a sequência nucleotídica. Esta alteração pode ser de diversos tipos: (i) deleção, inserção ou substituição de um ou poucos nucleotídeos, (ii) deleção de elementos genéticos, ou (iii) integração de elementos genéticos (e.g., transgenes), dentre outros. Contudo, é importante ressaltar que CRISPR pode ser usada para outros fins que não de edição genética, por exemplo: (i) marcação de DNA, (ii) regulação da expressão gênica, (iii) clivagem de RNA, (iv) mapeamento de genes ou (v) rastreamento de RNA.

O elemento central da técnica é uma endonuclease direcionada até o seu alvo específico por meio de um pequeno RNA-guia. Devido a isto, Cas9 é classificada como uma RGEN (RNA-guided endonuclease) (Kanchiswamy, 2016). Endonucleases são enzimas que clivagem (cortam) o ácido nucleico na parte interna da molécula, ao contrário das exonucleases, que cortam a partir das extremidades livres 5´ ou 3´.

De maneira integrada, CRISPR-Cas estão envolvidos no processo de imunidade antiviral adquirida. Baseados nesse processo biológico natural, pesquisadores desenvolveram a técnica de CRISPR-Cas9, que se utiliza de um RNA-guia (referindo-se assim a CRISPR) e apenas uma das proteínas Cas (a endonuclease Cas9). Para simplificação, muitos pesquisadores referem-se à técnica simplesmente como CRISPR. Contudo, note que recentemente sistemas alternativos têm se utilizado de outras endonucleases que não a Cas9, como a Cpf1 (CRISPR-Cpf1; Yamano et al., 2016).

O processo biológico da técnica. CRISPR é um loco bacteriano codificador de pequenos RNAs-guias de origem viral. A este loco estão associadas proteínas denominadas conjuntamente de Cas (CRISPR associated).

Assim, moléculas de RNA geradas a partir desses espaçadores seriam complementares ao patógeno (re)invasor, permitindo combatê-lo de maneira sequência-específica. Uma série de estudos subsequentes revelou ser esta hipótese verdadeira.

Baseado nesses achados, em 2005 foi postulada a hipótese de que CRISPR-Cas seria um sistema imune adaptativo de procariotos, no qual os espaçadores serviriam como “memória de invasões anteriores” (Mojica et al., 2015).

Adicionalmente, foi também descrito que vírus são incapazes de infectar com sucesso bactérias que possuem espaçadores cujas sequências são correspondentes a trechos de seus genomas (Bolotin et al., 2005).

Em 2005, três grupos independentes de pesquisadores mostraram que as sequências espaçadoras (ou simplesmente espaçadores) têm origem extracromossômica, isto é, são derivadas de plasmídeos ou de vírus.

Ao longo dos anos, um conjunto de genes fisicamente muito próximo ao loco CRISPR foi identificado e nomeado de genes Cas (CRISPR associated genes) (Jansen et al., 2002), exemplificados por nucleases, polimerases e helicases que viriam a se mostrar futuramente como elementos centrais no funcionamento do loco como um todo.

Uma ilustração sobre CRISPR

Mais tarde quando vc pesquisar sobre as vacinas, entenderá o que estamos falando

Guarde bem esta sigla (CRISPR) pois é o termo que se refere a técnica de edição do DNA.