В 33-х парсеках от Земли

Несем лакский в массы! Начали с дружественной лабы, подарив коробочку для всякой всячины с подписью. #lablife

Одним из центральных персонажей нового выпуска нашего подкаста стала Марико из сериала «Сёгун», а точнее, ее исторических прототип Грация Хосокава. Она была женщиной необычайного ума и трагической судьбы. Мы рассказали о том, как ее отец предал великого объединителя Японии Оду Нобунагу, как Грация приняла христианство и о многом другом. Послушать подкаст: Яндекс Музыка. Также мы есть на платформах Сastbox, Apple, и ВК. Слушайте, подписывайтесь, делитесь вашими впечатлениями!

Сортировка U2OS с mCherry-GFP-LC3. Базовые гейты по светорассеянию (живые клетки и синглеты) и смысловые (двумерная диаграмма mCherry vs GFP и гистограмма mCherry/GFP). Я выделил субпопуляцию вокруг моды mCherry/GFP. Процент светящихся клеток высокий, поскольку это вторая сортировка. Во время первой я в основном обогащал популяцию и немного срезал "хвосты" mCherry/GFP. Компенсацию не делал, поскольку до того проверял, что засветки нет (разные лазеры и относительно далекие каналы). P.S. Кстати, почему ни один сортер до сих пор не назвали Золушкой?

Сопоставимый уровень аутофагии в разных клетках означает не просто приблизительно одинаковую яркость клетки, но и постоянное соотношение красного и зеленого сигналов. Авторы одной хорошей статьи тоже решить отсортировать культуру вместо того, чтобы страдать. После селекции пуромицином клеток, инфицированных ретровирусами, они получили индивидуальные клоны, и, оценивая соотношение mCherry/GFP, выбрали среди них клоны с наименьшим разбросом - и соответственно, с наиболее однородным базовым уровнем аутофагии. Затем они отсортировали клетки после стимуляции аутофагии голоданием, сделав популяцию однородной по ответу. С моей точки зрения, голодание не очень удачное воздействие и я бы взяла, скажем, рапамицин или другие ингибиторы mTOR для большей стандартизации системы. А с другой - о чем они сами об этом говорят, - можно адаптировать модель под конкретный стресс, что звучит довольно разумно. Но... гипоксийно. Кроме того, я не вижу необходимости делать клоны в тех случаях, когда, собственно, нет острой необходимости, как, например, в случае с CRISPR/Cas. Мне в свое время рассказала об этом способе оценки аутофагии и подарила вектор с геном чудом американская профессор (одна из череды чудесных встреч, могу как-нибудь рассказать). Я переклонировала ген в вектор без гена устойчивости и заменила селекцию пуромицином на FACS, отсортировав масс-культуру узким разбросом соотношения mCherry/GFP. Следующий этап - измерение и сортировка со стрессом. #flowwithglow

Сопоставимый уровень аутофагии в разных клетках означает не просто приблизительно одинаковую яркость клетки, но и постоянное соотношение красного и зеленого сигналов. Авторы одной хорошей статьи тоже решить отсортировать культуру вместо того, чтобы страдать. После селекции пуромицином клеток, инфицированных ретровирусами, они получили индивидуальные клоны, и, оценивая соотношение mCherry/GFP, выбрали среди них клоны с наименьшим разбросом - и соответственно, с наиболее однородным базовым уровнем аутофагии. Затем они отсортировали клетки после стимуляции аутофагии голоданием, сделав популяцию однородной по ответу. С моей точки зрения, голодание не очень удачное воздействие и я бы взяла, скажем, рапамицин или другие ингибиторы mTOR для большей стандартизации системы. А с другой - о чем они сами об этом говорят, - можно адаптировать модель под конкретный стресс, что звучит довольно разумно. Но... гипоксийно. Кроме того, я не вижу необходимости делать клоны в тех случаях, когда, собственно, нет острой необходимости, как, например, в случае с CRISPR/Cas. Мне в свое время рассказала об этом способе оценки аутофагии и подарила вектор с геном чудом американская профессор (одна из череды чудесных встреч, могу как-нибудь рассказать). Я переклонировала ген в вектор без гена устойчивости и заменила селекцию пуромицином на FACS, отсортировав масс-культуру узким разбросом соотношения mCherry/GFP. Следующий этап - измерение и сортировка со стрессом. #flowwithglow

Нельзя просто так взять и оценить уровень аутофагии в клетках (с) Одна из моих текущих задач - получить новые репортерные линии для оценки аутофагии с помощью лентивирусной трансдукции и FACS. О разных способах оценки аутофагии в клетках я напишу позже, а сейчас рассмотрим, как обычно, то, что светится. О флуоресцентном сенсоре аутофагии я уже упоминал раньше. Вкратце, хитроумный химерный белок mCherry-GFP-LC3 подсвечивает аутофагосомы в обоих (красном и зеленом) каналах, а аутолизосомы - только в красном, поскольку GFP гаснет при низком рН. Поначалу использовали белок GFP-LC3, но поскольку он не подсвечивает аутолизосомы, поздняя аутофагия пропадала с радаров и оценка autophagic flux (как это будет по-русски, а?) оказывалась не очень корректной. И тогда придумали вариант с тандемом. Чтобы оценить уровень аутофагии и соотношение ранней/поздней, необходимо оценить соотношение mCherry и GFP. Для этого или измеряем соответствующий параметр на цитометре, или делаем фото и считаем светофоры mCherry+GFP+ аутофагосомы и mCherry+GFP- аутолизосомы. Этот способ оценки уровня аутофагии использован во многих статьях - например, можно заглянуть в эту. Традиционный подход - это, сделав трансфекцию или инфекцию лентивирусами, взять и вот так сразу посчитать желтые, красные и зеленые (зеленые?) точки, а потом страдать от больших разбросов. Согласно третьей благородной буддийской истине, от страдания можно избавиться, для чего надо устранить причину страдания, и в данном случае можно воспользоваться FACS. Сортировка хороша тем, что позволяет приятно и полезно провести время с ее помощью можно получать более-менее однородную масс-культуру (и при желании клоны) и создавать линии без устойчивости, чтобы не ограничивать выбор антибиотиков для последующих развлечений. #flowwithglow

Интересный пост про трудоустройство в Японии. https://t.me/shambaland/4505

Авторы одной хорошей статьи тоже решить отсортировать культуру вместо того, чтобы страдать. Они получили клоны, и сравнили

Друг написал мне пожелание-напоминание с монгольской пословицей "Эзэн хичээвэл заяа хичээнэ", которую можно перевести так: "Судьба борется за тех, кто борется сам". 🫡